Вскоре после её последнего появления в кино Хепбёрн была назначена специальным послом ЮНИСЕФ. Испытывая благодарность за собственное спасение в период после нацистской оккупации, она посвятила остаток своих дней улучшению судьбы детей, проживающих в беднейших странах мира. Работа Хепбёрн сильно облегчалась благодаря знанию целого ряда языков. Она разговаривала на французском, английском, испанском, итальянском и нидерландском языках. Она выучила итальянский, когда жила в Риме. Испанский она выучила самостоятельно, и существует съёмка ЮНИСЕФ, на которой Хепбёрн бегло говорит на испанском с жителями Мехико.
Хотя Хепбёрн начала сотрудничать с ЮНИСЕФ ещё в 1954 году, участвуя в радиопередачах, теперь это стало для неё более серьёзной работой. Близкие утверждают, что мысли об умирающих, беспомощных детях преследовали её всю оставшуюся жизнь. Её первая миссия была в Эфиопии в 1988. Она посетила детский дом с 500 голодающими детьми и добилась, чтобы ЮНИСЕФ выслал пищу.
В августе 1988 Хепбёрн ездила в Турцию участвовать в кампании по иммунизации. Она назвала Турцию самым ярким примером возможностей ЮНИСЕФ. По возвращении она сказала: «Армия дала нам грузовики, торговцы рыбой дали вагоны для вакцины, и как только дата была назначена, потребовалось только 10 дней, чтобы привить всю страну. Неплохо».
В октябре того же года Хепбёрн поехала в Южную Америку, где посетила Венесуэлу и Эквадор. Хепбёрн говорила: «Я видела как крошечные горные общины, трущобы и стихийные поселения каким-то чудом впервые получили системы водоснабжения, и этим чудом был ЮНИСЕФ. Я видела, как дети строили сами себе школы из кирпича и цемента, предоставленных ЮНИСЕФ».
В феврале 1989 года Хепбёрн совершила поездку по странам Центральной Америки и встречалась с главами Гондураса, Сальвадора и Гватемалы. В апреле в рамках миссии «Операция Линия Жизни» она вместе с Робертом Уолдерсом посетила Судан. Из-за гражданской войны продовольствие из гуманитарной помощи не поступало. Целью миссии было доставить продовольствие в Южный Судан.
В октябре того же года Хепбёрн и Уолдерс посетили Бангладеш.
В октябре 1990 Хепбёрн едет во Вьетнам, пытаясь наладить сотрудничество правительства с ЮНИСЕФ в рамках программ иммунизации и обеспечения питьевой водой.
Последняя поездка Хепбёрн (в Сомали) состоялась за четыре месяца до смерти, в сентябре 1992 года.
В 1992 президент США наградил её президентской медалью свободы в знак признания её работы в рамках ЮНИСЕФ, а Американская Академия Киноискусства наградила её Гуманитарной Премией им. Жана Хершолта за её помощь человечеству. Эта премия была присуждена ей посмертно и вручена её сыну.